Суспензійна культура

Крім культур калусних клітин в науковій практиці досить часто застосовуються культури клітинних суспензій і культури одиничних (одиночних) клітин. Для початку розглянемо суспензійну культуру.

Відео: культура клеток.avi

Суспензію клітин можна отримати з каллуса, помістивши його в рідку живильне середовище з автоматичним перемішуванням. Суспензійну культуру отримують безпосередньо з тканини експлантов. Культура складається з окремих клітин і агрегатів, що відокремилися від первинно утвореної калусних тканини. Необхідною умовою культивування клітинних суспензій є постійне перемішування на гойдалці (90 - 120 об / хв), ролерів різного типу, або струшування середовища. Якщо клітинна суспензія знаходиться в нерухомому стані, то проліферація суспензійних клітин призводить до утворення калусних тканини. Також необхідними умовами підтримки культури є аерація, оптимальні температури (20-30оС), а також певний обсяг і фізіологічний стан інокулюму (частина клітинної суспензії, яка використовується для перенесення на свіжу середу). Мінімальний обсяг інокулюму, необхідний для росту культури, залежить від виду об`єкта, фази росту і складу культурального середовища. При занадто великих обсягах ріст клітин в суспензії може інгібувати через накопичення токсичних продуктів метаболізму, або через нестачу поживного субстрату.

Початковий момент отримання суспензійний клітинної культури є рандоміческім подією. Це означає, що тільки клітини, які по ряду причин здатні до перебудови метаболізму і розмноження з високим коефіцієнтом в даних конкретних умовах суспензійного культивування, утворюють «хороші» лінії. Важливими характеристиками іакіх ліній є високий ступінь дезінтеграції (5-10 клітин в групі), морфологічна вирівняність клітин. На малюнку показані мікрофотографії суспензійних клітин відповідають цим критеріям.

Морфологічна варіабельність клітин суспензійних культур не надто висока: зустрічаються поодинокі розтягнулися клітини, що містять величезну вакуоль і пристінковий шар цитоплазми з великим ядром- клітини меншого розмір, округлі або овальні, в тій чи іншій мірі вакуолізірованние, з більш щільною цитоплазмою, поодинокі або утворюють агрегати.

Суспензії краще утворюються з пухкого каллуса, одержуваного на середовищах з 2,4-Д. Виняток з живильного середовища іонів кальцію полегшує суспензірованіе. Ще більше полегшує цей процес додавання в середовище пектідази, здатної гідролізувати пектинові зв`язку в клітинній стінці.

Крива росту клітин в суспензії, як і клітини калусних культури, має S - подібну форму.

Вирощування клітинних суспензій в рідкому поживному середовищі має ряд переваг перед вирощуванням калусних тканин поверхневим способом. Тут легше і більш відтворено впливати на метаболізм і зростання клітинних популяцій екзогенними факторами. Вони зручніше для біохімічних і молекулярно-біологічних експериментів - вивчення індукції ферментів і зв`язку їх з подіями клітинного циклу, експресії і репресії певних генів, ізолювання і характеристик мутантів.

Роботи з культивування та субкультівірованія проводять в асептичних умовах.

Первинну суспензію перед субкультивуванням фільтрують через 1 - 2 шари марлі, нейлонові або металеві сита, щоб позбутися від великих, щільних шматків калусних тканини, залишків експлантов і дуже великих агрегатів. Фільтрування рекомендується і в кількох наступних субкультівірованія до придбання клітинної суспензією бажаних характеристик. Однак агрегованість суспензії залежить не тільки від характеристик початкової лінії, але і від умов культивування.

Способи вирощування, розроблені в мікробіології, застосовуються для глибинного культивування рослинних клітин. Використовуються закриті або відкриті системи в періодичному або проточному режимах. У закритій системі при періодичному режимі вирощування клітинна маса (інокулюм) поміщається в певний обсяг середовища. До кінця вирощування система залишається закритою за всіма параметрами, крім газів. У закритій культурі в систему періодично подається свіжа живильне середовище, а стара видаляється в тому ж обсязі. Клітини при цьому залишаються в системі протягом усього циклу вирощування.

У відкриті проточні культури періодично (або безперервно) надходить свіжа живильне середовище, однак відбирається не тільки стара середовище, а й частина врожаю клітинної маси. Регуляція цього процесу може здійснюватися за принципом турбідостата або Хемостат. У турбідостате подача свіжої середовища, і відбір суспензії відбуваються після досягнення клітинної популяцією певної заданої щільності. Сигнал на включення протоки надходить від реле, пов`язаного з оптичною системою, яка визначає щільність клітин. У хемостате швидкість протоку задається експериментатором і від неї залежить швидкість росту клітинної маси. Для цього живильне середовище лімітується по одному з найбільш важливих для росту факторів, найчастіше по фосфору, азоту або цукру. Режим Хемостат дозволяє за допомогою фіксованої швидкості розведення підтримувати константну швидкість ділення і щільність клітин в популяції.

Відео: Мікроводорості в рослинництві. Хлорела, носток, анабаена

Клітинні суспензії в біотехнології використовуються для отримання вторинних метаболітів, багато з яких є цінними лікарськими препаратами, для промислового вирощування клітинної біомаси і для клітинної селекції. Поряд з цим, суспензії клітин можна застосовувати в якості вихідного матеріалу для отримання ізольованих протопластів. Для промислового отримання продуктів вторинного синтезу з великих клітинних мас використовують ферментери великої місткості (від 20000 і більше літрів), в яких проводять безперервне культивування клітин. Суспензійні культури можуть бути не тільки джерелом цінних вторинних метаболітів, але в них виявлені також другте з`єднання, наприклад, камптотецин, харрінгтонін і інші антиканцерогени, пептиди (інгібітор протеаз, інгібітор фітовірусів) і ін. Слід зазначити, що поділ клітин, що приводить до збільшення клітинної біомаси, і синтез вторинних метаболітів роз`єднані в часі. Синтез вторинних метаболітів досягає максимуму в стаціонарній фазі росту.

Поділися в соц мережах:

Увага, тільки СЬОГОДНІ!

Схожі